Caracterización del perfil de fosforilación de SGK1 y SGK1.1

Abstract

La epilepsia es un trastorno neurológico caracterizado por convulsiones o crisis recurrentes no provocadas, desencadenadas por una descarga paroxística anormal y síncrona de una determinada población neuronal. Cerca del 30% de los pacientes son resistentes a los tratamientos existentes, un hecho que impulsa el estudio en profundidad de los mecanismos de regulación de la excitabilidad neuronal en busca de nuevas y posibles dianas terapéuticas. Se ha descrito que la isoforma neuronal de la proteína quinasa SGK1 (serum and glucocorticoidregulated kinase 1), SGK1.1, regula los canales de potasio Kv7, involucrados en el control de la excitabilidad neuronal. Este proyecto persigue desarrollar dos líneas celulares modificadas genéticamente que expresen selectivamente los genes SGK1 y SGK1.1 mediante la tecnología CRISPR-Cas9. Los clones celulares obtenidos de ambas subpoblaciones serán analizados para constatar la correcta inserción y expresión de las secuencias transgénicas mediante PCR, microscopía confocal y western blot. Se utilizarán anticuerpos fosfoespecíficos para dianas conocidas de fosforilación de SGK1 y SGK1.1 (GSK3ß) para asegurar la funcionalidad de las proteínas expresadas. Estas células serán utilizadas para descubrir las vías de señalización utilizadas por SGK1.1 para aumentar la expresión Kv7 y comprender los mecanismos de su papel neuroprotector.

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent and unprovoked seizures and crisis, triggered by an abnormal and synchronous discharge of a certain neuronal population. Around 30% of epileptic patients are resistant to existing treatments, a fact that encourages the study of the mechanisms of regulation of neuronal excitability in search of new and potential therapeutic targets. The neuronal isoform of the serum and glucocorticoid-regulated kinase (SGK1.1) has been described to regulate Kv7 potassium channels, involved in the control of neuronal excitability. This project aims at developing two cell lines genetically modified to express SGK1 and SGK1.1 genes through CRISPR-Cas9 technology. The cell clones obtained from both subpopulations will be analyzed to verify the correct insertion and expression of the transgenic sequences by means of PCR analysis, confocal microscopy and western blot. Phospho-specific antibodies against known targets of phosphorylation of SGK1 and SGK1.1 (GSK3ß) will be used to ensure the functionality of the expressed proteins. These cells will be studied to discover the signaling pathways used by SGK1.1 to increase Kv7 expression and understand the mechanisms of its neuroprotective role.