Localización subcelular del transportador de nucleótidos vesicular por inmunofluorescencia en cultivos neuronales

Abstract

Este trabajo constituye uno de los primeros pasos de una línea de investigación emergente en el laboratorio, que pretende detectar la liberación por exocitosis de vesículas que contienen ATP en neuronas de hipocampo in vitro. Por ello, se han puesto a punto tres tipos de cultivos de neuronas: cultivos continentales, cultivos autápticos y cultivos por el método de Banker. Las muestras obtenidas de cultivos continentales y por el método de Banker se emplearon para marcar por inmunofluorescencia el Transportador Vesicular de Nucleótidos (VNUT) y otras proteínas neuronales y gliales. En co-cultivos, la presencia de VNUT en neuronas y células gliales hace que al analizar la fluorescencia sea complicado distinguir entre la señal de VNUT en neuronas y señal de VNUT en glía. Por ello, se proponen los cultivos por el método de Banker como modelo para el estudio de la localización subcelular de VNUT en neuronas de hipocampo. La fluorescencia detectada para VNUT se encuentra fundamentalmente en regiones neuronales correspondientes a dendritas y soma. Aunque con los métodos empleados no se detecte, no se descarta la presencia de VNUT en regiones neuronales como los axones y los terminales presinápticos.

This work is one of the firsts steps of an emerging line of research in the laboratory, which aims to detect the release by exocytosis of vesicles containing ATP in hippocampal neurons in vitro. Therefore, three types of neuronal cultures have been developed: continental cultures, autaptic cultures and Banker's method cultures. Samples obtained from continental and Banker cultures were used for immunofluorescence labeling of Vesicular Nucleotide Transporter (VNUT) and other neuronal and glial proteins. In co-cultures, when fluorescence is analysed, the presence of VNUT in neurons and glial cells makes it complicated to distinguish between VNUT signal in neurons and VNUT signal in glia. Therefore, Banker cultures are proposed as a model for studying the subcellular localization of VNUT in hippocampal neurons. The fluorescence detected for VNUT is found mainly in neuronal regions corresponding to dendrites and soma. Although it is not detected with the methods used, the presence of VNUT in neuronal regions such as axons and presynaptic terminals, is not ruled out.