Estudio de factores que puedan regular la actividad antiviral de HDAC6, y efecto sobre la capacidad proviral del complejo de envoltura de virus primarios de pacientes VIH+

Abstract

El VIH/SIDA sigue siendo una amenaza global, a pesar de los notables esfuerzos realizados por las comunidades científica y sanitaria para comprender la infección viral, el diseño de nuevos fármacos o la mejora de los existentes, así como del desarrollo de terapias avanzadas y diseño de potenciales vacunas para lograr la cura funcional y la erradicación viral. La identificación y el análisis de individuos VIH-1 positivos que controlan naturalmente la replicación viral, en ausencia de tratamiento antirretroviral, ha brindado pistas sobre los procesos celulares que pueden regular las proteínas y el ARN del virus, y que condicionan los procesos de replicación viral y de progresión clínica de la infección, así como la patología asociada. En la presente tesis doctoral, el principal objetivo de estudio se ha centrado en la proteína de unión al ADN de respuesta transactiva (TAR) 43 (“transactive response DNA-binding protein” (TARDBP o TDP-43)) la cual es reguladora importante del ARNm y, entre otros factores, de la enzima con actividad anti-VIH- 1, histona desacetilasa 6 (HDAC6). La sobreexpresión del constructo funcional parenteral de TDP-43 estabiliza los niveles de ARNm y de proteína de HDAC6, garantizando así sus funciones antivirales en células diana para la infección, afectando a la formación del poro de fusión e inhibiendo la infección por VIH-1, gracias a la actividad desacetiladora de microtúbulos (MT) de la enzima HDAC6, que actúa de forma independiente al tropismo del complejo de envoltura del virus. La regulación de la permisividad celular frente a la infección por VIH-1 por el eje TDP-43/HDAC6, se corrobora por silenciamiento específico del ARNm de TDP- 43, teniendo como consecuencia la disminución en los niveles tanto del ARNm como de la proteína de HDAC6, lo que genera un estatus celular de estabilización de MT que favorece la formación del poro de fusión y la infección del VIH-1, tras el contacto de la Env con el receptor CD4, debido a la reorganización de los MT y su modificación postraduccional por acetilación (por los niveles bajos de HDAC6). Además, y considerando que la Env del VIH-1 es un determinante citopático importante en la infección y replicación viral, y para determinar la funcionalidad viral de Env de virus primarios procedentes de pacientes VIH-1 positivos con fenotipos extremos, se caracterizaron varias Env provenientes de pacientes virémicos no progresores (VNP) o rápidos progresores (RP). Para ello, se realizó un análisis exhaustivo sobre distintos parámetros funcionales de la Env, observándose que los clones de Env, seleccionadas de ambos grupos de pacientes, mostraron capacidades similares de expresión, una afinidad similar por CD4, puesta de manifiesto en ensayos de transmisión de material viral célulacélula y de señalización por CD4 (medidos por acetilación de la subunidad atubulina de los MT), que rigen la capacidad de fusión de membrana (formación del poro de fusión) y de infección, siendo similares en estas Env funcionales. Además, las Env de los dos grupos inducen autofagia tardía por contacto con CD4 en células no infectadas, característica que correlaciona directamente con la actividad fusogénica de las Env. En el caso de los pacientes VNP, no se observa una relación entre la función autofágica tardía letal de las Env virales con la progresión de la enfermedad, si bien los clones de Env de individuos VNP son completamente funcionales y explicaría la viremia en estos pacientes. Todo apunta a que en pacientes VNP el estatus inmunitario aporta cierta estabilidad al fenotipo clínico no progresor. Como prueba de concepto, estas observaciones se confirmaron mediante el estudio de Env virales primarias de individuos infectados por VIH-1 con diferentes fenotipos clínicos, bajo las condiciones experimentales de sobreexpresión de TDP-43. Un aumento en el nivel de expresión de la proteína funcional de TDP-43 redujo fuertemente la actividad de infección de Env de individuos VNP y RP infectados por VIH-1 hasta los niveles de infección detectado para Env provenientes de pacientes controladores de élite, no progresores a largo plazo (LTNP-EC), cuya función viral es deficiente. Por el contrario, niveles bajos de TDP-43 endógeno, inducidos por silenciamiento específico mediante oligonucleótidos interferentes siRNA-TDP-43, favorecen significativamente la actividad de infección de Env primarias de VIH-1 de individuos VNP y RP. Sorprendentemente, el silenciamiento de TDP-43, que reduce los niveles de HDAC6 (su ARNm y proteína), generando un estado celular más permisivo a la infección, permite incluso la infección eficaz celular con pseudovirus portando Env primarias, deficientes en la función viral, de individuos LTNP-EC. Del mismo modo, se estudia cómo TDP-43 ejerce un efecto regulador sobre HDAC6 en células productoras de viriones, al garantizar, mediante la estabilización en los niveles de ARN mensajero (ARNm) y proteína, las funciones autofágicas degradativas de la enzima desacetilasa. Debido a ello, los niveles de proteínas virales Pr55Gag y Vif se ven reducidos, afectando así a la replicación, producción de viriones e infectividad de los mismos. Tras el silenciamiento de TDP-43, se comprueba cómo la actividad autofágica dependiente de HDAC6 se ve reducida, aumentando así la producción viral y la infectividad de los virus generados bajo estas condiciones experimentales, evidenciando la capacidad reguladora de TDP-43 sobre HDAC6 y, consecuentemente, sus actividades antivirales.

HIV/AIDS remains a global threat despite the remarkable efforts made by the scientific and health communities to understand this viral infection, to design new drugs or improve existing ones, as well as develop advanced therapies and design vaccines for functional cure, prevention and viral eradication. The identification and analysis of HIV-1 positive individuals who naturally control viral replication in the absence of antiretroviral treatment has provided clues about the cellular processes that might interact with viral proteins and RNA, and define subsequent viral replication and clinical progression. Thus, in this doctoral thesis, the object of study has been focused on the transactive response (TAR) DNA-binding protein (TARDBP or TDP-43), which is an important regulator of mRNA and is known to stabilize the anti-HIV-1 factor, histone deacetylase 6 (HDAC6). The overexpression of the TDP-43 wild type construct stabilizes HDAC6 mRNA and protein levels, thus guaranteeing its antiviral functions in permissive cells for infection, impairing the formation of the fusion pore due to the deacetylating activity in microtubules (MTs) of HDAC6 and independently of the tropism of the viral envelope complex of the virus and, therefore, decreasing the infection ability of the virus. The regulation of cell permissiveness against HIV-1 infection by the TDP-43/HDAC6 axis is corroborated by specific silencing of TDP-43 mRNA, resulting in a decrease in both mRNA and protein levels. of HDAC6, which generates a cellular status of MT stabilization that favors the formation of the fusion pore and the infection of HIV-1, after contact of Env with the CD4 receptor, due to the reorganization of the MTs and their modification post-translational by acetylation (because of low levels of HDAC6). In addition, and considering that the Env of HIV-1 is an important cytopathic determinant in viral infection and replication, and to determine the viral functionality of Env from primary viruses with extreme phenotypes, several Env from viremic non-progressors patients (VNP) or rapid progressors (RP) were characterized. For this, an exhaustive analysis was carried out on different functional parameters of the Env, observing that the Env clones, selected from both groups of patients, showed similar expression capacities, a similar affinity for CD4, revealed in transmission tests of cell-cell viral material and CD4 signaling (measured by acetylation of the a-tubulin subunit of MT), which govern the capacity for membrane fusion (formation of the fusion pore) and infection, being similar in these functional Env . In addition, the Env of the two groups induce late autophagy by contact with CD4 in uninfected cells, a characteristic that directly correlates with the fusogenic activity of the Env. In the case of VNP patients, no relationship is observed between the lethal late autophagic function of viral Env with disease progression, although the Env clones of VNP individuals are fully functional and would explain the viremia in these patients. All these data points to the fact that in VNP patients the immune status provides a certain stability to the non-progressor clinical phenotype. As a proof of concept, these observations were confirmed by studying primary viral Env from HIV-1 infected individuals with different clinical phenotypes, under the experimental conditions of TDP-43 overexpression. An increase in the expression level of wt-TDP-43 strongly reduced Env infection activity from HIV-1 infected VNP and RP individuals to the infection levels detected for Env from elite controllers long-term non-progressors patients (LTNP-EC), whose viral function is impaired. In contrast, low levels of endogenous TDP-43, induced by specific silencing with interfering oligos siRNA-TDP-43, significantly favor the infection activity of primary HIV-1 Env from VNP and RP individuals. Surprisingly, the silencing of TDP-43, which reduces the levels of HDAC6 (its mRNA and protein), generating a cellular state more permissive to infection, even allows efficient cellular infection with pseudoviruses carrying primary Env, deficient in viral function, of LTNP-EC individuals. In the same way, it is also verified how TDP-43 exerts a regulatory effect on HDAC6 in virion-producing cells, by guaranteeing, by stabilizing the levels of mRNA and protein, the autophagic degrading functions of the deacetylating enzyme. Due to this, the levels of viral proteins Pr55Gag and Vif are reduced, thus affecting their replication, virion production and infectivity. After the silencing of TDP-43, it is verified how the autophagic activity dependent on HDAC6 is reduced, thus increasing the viral production and the infectivity of the viruses generated under these experimental conditions, evidencing the regulatory capacity of TDP- 43 on HDAC6 and, consequently, its antiviral activities.