Development of a hands-on genomics educational tool using mitochondrial DNA PCR-free enrichment and MinION-based species apportionment

Abstract

Identification of different species can be performed attending to the variation in the DNA sequences. Mitochondrial DNA (mtDNA) constitutes the ideal model as it provides an opportunity for eukaryotic classification as it is available from a large number of metazoan species. We aimed to devise a protocol to allow the sequencing of the mtDNA without using PCR with cutting-edge third-generation next generation sequencing (NGS) technology to identify eukaryotic organisms. Two procedures were assessed for mtDNA enrichment from distinct food products: the commercial solution QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), and the home-made protocol of classic alkaline lysis for plasmid isolation. The enrichment of mtDNA versus nuclear DNA was evaluated by quantitative real-time PCR and short-read sequencing. As a proof of concept, a mock sample with the DNAs from the best performing enrichment protocol was finally processed with MinION (Oxford Nanopore Technologies) and NanoDJ to allow a qualitative identification of the food components. While the protocols still need improvements to facilitate sample processing, we envisage this hands-on experience as a learning-by-doing instrument for transdisciplinary education adapted to basic laboratory resource settings. Keywords: Nanopore sequencing; educational tool; genomics; species classification

La identificación de especies se puede realizar atendiendo a las variaciones en las secuencias de ADN. El ADN mitocondrial (ADNmt) constituye un modelo ideal ya que proporciona la oportunidad para la clasificación de eucariotas y está disponible para un gran número de especies de animales. En este trabajo propusimos diseñar un protocolo que permita la secuenciación del ADNmt sin usar PCR mediante tecnología de secuenciación de última generación para identificar organismos eucariotas. Se evaluaron dos protocolos para el enriquecimiento del ADNmt a partir de distintos productos alimenticios: el preparado comercial QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN) y el protocolo casero de lisis alcalina clásica para el aislado de plásmidos. Se evaluó el enriquecimiento del ADNmt frente al ADN nuclear por PCR cuantitativa a tiempo real y por secuenciación de lecturas cortas. Como prueba de concepto, a partir del mejor protocolo de enriquecimiento se procesó una muestra simulada de ADN con el MinION (Oxford Nanopore Technologies) y se usó NanoDJ para obtener una identificación cualitativa de los componentes de los alimentos. Aunque los protocolos todavía necesitan mejoras para facilitar el procesado de las muestras, consideramos este experimento como un instrumento de aprendizaje para la educación transdisciplinaria adaptada a los entornos de laboratorio con recursos básicos. Palabras clave: Secuenciación en nanoporos; herramienta educativa; genómica; clasificación de especies