Optimización de la edición de embriones de ratón mediante CRISPR/Cas9

Abstract

Los ratones modificados genéticamente cada vez cobran mayor importancia en investigación. Una técnica novedosa y relativamente sencilla para obtenerlos, es la utilización del sistema CRISPR/Cas9, introduciendo los reactivos necesarios en el embrión mediante electroporación. Este trabajo se centra en la optimización de las condiciones para electroporar los embriones en estadío 0,5 e incubarlos hasta la fase de blastocisto. Se probaron dos opciones de edición genética: NHEJ (del inglés Non-Homologous End Joining) para conseguir la deleción de un gen y HDR (del inglés Homology-Directed Repair) para introducir un fragmento de ADN de interés en un sitio específico del genoma. Además, también se probó la eficiencia de las ediciones genéticas cuando se introdujo el sistema CRISPR/Cas9 en el embrión en forma de ribonucleoproteína o como plásmidos. El porcentaje de embriones que alcanzaron el estadío de blastocisto fue de aproximadamente un 23%, que no es un valor muy alto, por lo que se debe seguir optimizándolas condiciones para conseguir una mayor viabilidad y supervivencia. Por otro lado, se logró editar genéticamente en los embriones y detectar dicha edición en fase de blastocisto tanto por PCR como por el ensayo de la T7 endonucleasa. Por lo que se demuestra, que realizando la estrategia adecuada se puede determinar en estadío de blastocisto, si esa modificación genética se produce con una elevada frecuencia y es viable; permitiendo esto pasar a la obtención del ratón genéticamente modificado con seguridad.

Genetically modified mice are becoming increasingly important in research. A novel and relatively simple technique to obtain them is the use of the CRISPR/Cas9 system, introducing the necessary reagents into the embryo by electroporation. This work focuses on optimizing the conditions for electroporating stage 0.5 embryos and incubating them until the blastocyst stage. Two gene editing options were tested: NHEJ (Non-Homologous End Joining) to achieve gene deletion and HDR (Homology-Directed Repair) to introduce a DNA fragment of interest in a specific site of the genome. In addition, the efficiency of gene editing was also tested when the CRISPR/Cas9 system was introduced into the embryo in the form of ribonucleoprotein or as plasmids. The percentage of embryos that reached the blastocyst stage was approximately 23%, which is not a very high value, so conditions should be further optimized to achieve greater viability and survival. On the other hand, it was possible to genetically edit the embryos and to detect such editing in the blastocyst stage both by PCR and by the T7 endonuclease assay. Thus, it is demonstrated that by carrying out the appropriate strategy it is possible to determine at the blastocyst stage, if this genetic modification occurs with a high frequency and is viable; allowing this to go on to obtain the genetically modified mouse with certainty.