Development of a hands-on genomics educational tool using mitochondrial DNA PCR-free enrichment and MinION-based species apportionment
Fecha
2018Resumen
Identification of different species can be performed attending to the variation in the
DNA sequences. Mitochondrial DNA (mtDNA) constitutes the ideal model as it
provides an opportunity for eukaryotic classification as it is available from a large
number of metazoan species. We aimed to devise a protocol to allow the sequencing of
the mtDNA without using PCR with cutting-edge third-generation next generation
sequencing (NGS) technology to identify eukaryotic organisms. Two procedures were
assessed for mtDNA enrichment from distinct food products: the commercial solution
QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN), and the home-made protocol of classic alkaline
lysis for plasmid isolation. The enrichment of mtDNA versus nuclear DNA was
evaluated by quantitative real-time PCR and short-read sequencing. As a proof of
concept, a mock sample with the DNAs from the best performing enrichment protocol
was finally processed with MinION (Oxford Nanopore Technologies) and NanoDJ to
allow a qualitative identification of the food components. While the protocols still need
improvements to facilitate sample processing, we envisage this hands-on experience as
a learning-by-doing instrument for transdisciplinary education adapted to basic
laboratory resource settings.
Keywords: Nanopore sequencing; educational tool; genomics; species classification La identificación de especies se puede realizar atendiendo a las variaciones en las
secuencias de ADN. El ADN mitocondrial (ADNmt) constituye un modelo ideal ya que
proporciona la oportunidad para la clasificación de eucariotas y está disponible para un
gran número de especies de animales. En este trabajo propusimos diseñar un protocolo
que permita la secuenciación del ADNmt sin usar PCR mediante tecnología de
secuenciación de última generación para identificar organismos eucariotas. Se evaluaron
dos protocolos para el enriquecimiento del ADNmt a partir de distintos productos
alimenticios: el preparado comercial QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN) y el protocolo
casero de lisis alcalina clásica para el aislado de plásmidos. Se evaluó el
enriquecimiento del ADNmt frente al ADN nuclear por PCR cuantitativa a tiempo real
y por secuenciación de lecturas cortas. Como prueba de concepto, a partir del mejor
protocolo de enriquecimiento se procesó una muestra simulada de ADN con el MinION
(Oxford Nanopore Technologies) y se usó NanoDJ para obtener una identificación
cualitativa de los componentes de los alimentos. Aunque los protocolos todavía
necesitan mejoras para facilitar el procesado de las muestras, consideramos este
experimento como un instrumento de aprendizaje para la educación transdisciplinaria
adaptada a los entornos de laboratorio con recursos básicos.
Palabras clave: Secuenciación en nanoporos; herramienta educativa; genómica;
clasificación de especies